Γρήγορη και αυτοματοποιημένη εκτύπωση προσαρμοσμένων ολίγο

Γρήγορη και αυτοματοποιημένη εκτύπωση προσαρμοσμένων ολίγο

September 7, 2022 0 Von admin

Συμβατικά, τα ολιγονουκλεοτίδια έχουν συντεθεί χρησιμοποιώντας χημεία φωσφοραμιδίτη – μια τεχνική που αναπτύχθηκε το 1981 και εξακολουθεί να χρησιμοποιείται ευρέως στη βασική και εφαρμοσμένη έρευνα.1 Ωστόσο, αυτή η προσέγγιση έχει αρκετούς περιορισμούς. Η αποτελεσματικότητα της σύνθεσης φωσφοραμιδίτη μειώνεται πέρα ​​από ~ 200-mers. Η ροή εργασιών κατασκευής, επεξεργασίας και καθαρισμού απαιτεί σημαντική χειρωνακτική εργασία, η οποία προστίθεται στους χρόνους μεταφοράς και τις διακυμάνσεις στις κατασκευαστικές ικανότητες και την επιμελητεία, μπορεί να οδηγήσει σε μεγάλους χρόνους διεκπεραίωσης και καθυστερήσεις στους ερευνητές να παραλάβουν τα ολιγομελή τους. Επιπλέον, η οργανική χημεία φωσφοραμιδίτη δημιουργεί επικίνδυνα απόβλητα και δημιουργεί περιβαλλοντικούς κινδύνους.

Οι ερευνητές μπορούν τώρα να χρησιμοποιήσουν την τεχνολογία ενζυμικής σύνθεσης DNA (EDS) για να συνθέσουν ειδικά σχεδιασμένα ολιγονουκλεοτίδια στον πάγκο του εργαστηρίου χωρίς εξειδικευμένη εκπαίδευση, χειρισμό σκληρών οργανικών χημικών ουσιών ή παρατεταμένους χρόνους ανανέωσης. Η πλατφόρμα SYNTAX2που αναπτύχθηκε από την DNA Script, μια εταιρεία σύνθεσης DNA με διαταραχές που εδρεύει στο Νότιο Σαν Φρανσίσκο, επιτρέπει την προσαρμοσμένη εκτύπωση DNA κατά παραγγελία χρησιμοποιώντας την τεχνολογία EDS.

Σε αποκλειστική συνέντευξη με ΓΕΝ, Ο Thomas Ybert, PhD, Διευθύνων Σύμβουλος και συνιδρυτής του DNA Script, λέει: «Όπως η φύση, το EDS χρησιμοποιεί ένζυμα – όχι σκληρή οργανική χημεία. Σκεφτείτε αυτά τα ένζυμα ως νανορομπότ που λειτουργούν για την κατασκευή μορίων DNA. Το EDS μας δημιουργεί βιώσιμη, πιο πράσινη τεχνολογία με μειωμένο περιβαλλοντικό αντίκτυπο. Στην πράξη, είναι ασφαλέστερο για το περιβάλλον και αντιμετωπίζεται εύκολα από τυπικές ροές αποβλήτων στα περισσότερα εργαστήρια μοριακής βιολογίας».

Το σύστημα αποτελείται από τρία μέρη: ένα επιτραπέζιο όργανο DNA-On-Demand, λογισμικό κονσόλας SYNTAX και ένα κιτ αναλώσιμων αντιδραστηρίων που περιλαμβάνει τέσσερα μελάνια που αντιπροσωπεύουν τα δομικά στοιχεία του DNA: A, T, C και G. Αυτό το σύστημα μπορεί να εκτέλεση αυτοματοποιημένης σύνθεσης, καθαρισμού, ποσοτικοποίησης και κανονικοποίησης σε ένα μόνο μηχάνημα. Η τεχνική είναι μια απλή, γρήγορη και αξιόπιστη εναλλακτική λύση στην τεχνική της χημικής σύνθεσης δεκαετιών.3

Ο Ybert προσθέτει, «Δημιουργώντας μια λύση για τις εταιρείες να ελέγχουν τις ροές εργασίας τους και τον χρόνο διεκπεραίωσης εκτυπώνοντας DNA κατ‘ απαίτηση εσωτερικά, δίνουμε τη δυνατότητα στους ερευνητές να επιταχύνουν τον επαναληπτικό κύκλο σχεδίασης-εκτύπωσης-δοκιμής και εξαλείφουν τη χρονοβόρα διαδικασία της εξωτερικής ανάθεσης παραγωγής που τελικά οδηγεί σε επιβράδυνση της καινοτομίας».

Αυτό το άρθρο θα καλύψει τη ροή εργασιών σύνθεσης της τεχνολογίας EDS και τις τρεις βασικές καινοτομίες που συνθέτουν τη βιοχημεία της.

Το σταθερό στήριγμα

Το στερεό στήριγμα της πλατφόρμας EDS έχει δύο βασικά συστατικά: ένα στερεό υποστήριγμα DNA με βάση τη ρητίνη και ένα μόριο DNA με δυνατότητα διάσπασης συνδετήρα, που είναι συνδεδεμένο σε αυτό, γνωστό ως «αρχικό DNA» (iDNA). Η λειτουργία αυτού του συμπλέγματος είναι η έναρξη της σύνθεσης διασφαλίζοντας παράλληλα ότι οι χημικές και φυσικές ιδιότητες είναι βέλτιστες για ενζυμική αντίδραση. Το iDNA μπορεί να βελτιστοποιηθεί αλλάζοντας το μήκος του για να ελαχιστοποιηθεί η στερική παρεμπόδιση κατά την ενζυματική επιμήκυνση. Περιλαμβάνει μια συγκεκριμένη θέση αποκοπής για να εξασφαλίσει την απελευθέρωσή της μετά την ολοκλήρωση της σύνθεσης.

Ένζυμο σύνθεσης: τερματική δεοξυνουκλεοτιδυλ-τρανσφεράση (TdT)

Το ένζυμο TdT είναι μια εξειδικευμένη πολυμεράση DNA που βρίσκεται σε ανώριμα, προ-Β, προ-Τ λεμφοειδή κύτταρα και σε κύτταρα οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας ή λεμφώματος. Αυτό το ένζυμο είναι μοναδικό επειδή μπορεί να εισάγει επιπλέον νουκλεοτίδια στο 3′ άκρο ενός μορίου DNA, και σε αντίθεση με τις περισσότερες πολυμεράσες DNA, δεν απαιτεί μήτρα.4,5 Το TdT ανήκει στην οικογένεια Χ πολυμερασών DNA που εισάγει γενετική ποικιλομορφία κατά τον ανασυνδυασμό γονιδίων ωρίμανσης ανοσίας. Το κάνει ειδικά προσθέτοντας νουκλεοτίδια στα 3′-άκρα της μεταβλητής (V), της ποικιλομορφίας (D) και ενώνοντας (J) τμήματα γονιδίου αντισωμάτων με τυχαίο, ανεξάρτητο από το πρότυπο τρόπο.

Το ένζυμο TdT έχει κατασκευαστεί in vitro από το DNA Script για να καταλύει γρήγορες και εκλεκτικές προσθήκες πολυνουκλεοτιδίων στο iDNA με υψηλή πιστότητα και αποτελεσματικότητα σύζευξης.

«Αυτή η μοναδική ικανότητα του TdT να δημιουργεί γονιδιωματικό υλικό de novo έχει χρησιμοποιηθεί από καιρό για την επισήμανση ολιγονουκλεοτιδίων σε ένα ευρύ φάσμα εφαρμογών. Καθιστά επίσης το TdT, κατασκευασμένο όπως έχουμε, ως το ένζυμο επιλογής για το EDS», λέει ο Ybert. «Τα ιδιόκτητα ένζυμα EDS μας έχουν κατασκευαστεί για να προσθέτουν γρήγορα και επιλεκτικά τα αναστρέψιμα τερματισμένα νουκλεοτίδια μας στο 3′-άκρο οποιουδήποτε κλώνου DNA – το πλαίσιο της αλληλουχίας δεν έχει σημασία. Επιπλέον, το TdT μας επιτρέπει μεγαλύτερο μήκος ολίγο. Εσωτερικά, έχουμε επιτύχει μήκος έως και 360 νουκλεοτιδίων. Τα οφέλη είναι ξεκάθαρα».

Αναστρέψιμα τερματισμένα νουκλεοτίδια

Στη διαδικασία EDS χωρίς πρότυπο για σύνθεση ολιγονουκλεοτιδίων, πρέπει να χρησιμοποιηθούν στρατηγικές για να διασφαλιστεί ότι η επιδιωκόμενη βάση και μόνο ένα μόριο της επιδιωκόμενης βάσης προστίθεται στο αναπτυσσόμενο ολιγονουκλεοτίδιο σε κάθε κύκλο σύνθεσης. Το σύστημα SYNTAX του DNA Script το επιτυγχάνει αυτό μέσω της χρήσης τροποποιημένων δομικών στοιχείων (τριφωσφορικά δεοξυ-νουκλεοτίδια, dNTPs).

«Αναπτύξαμε ένα σύνολο νουκλεοτιδίων που ελέγχουν τη διαδικασία EDS διακόπτοντας αποτελεσματικά τη σύνθεση μετά από μία προσθήκη βάσης και στη συνέχεια ξεκινώντας ξανά τον κύκλο για να προσθέσουμε μια νέα βάση. Όπως και άλλες εφαρμογές, για παράδειγμα η αλληλουχία Illumina, το κάνουμε αυτό χρησιμοποιώντας νουκλεοτίδια με τροποποιημένη 3′-υδροξυλική ομάδα -ή αναστρέψιμα τερματισμένα dNTPs – που εμποδίζουν την επέκταση της αναπτυσσόμενης αλυσίδας DNA», εξηγεί ο Ybert.

Η τροποποίηση αφαιρείται σε κάθε κύκλο χρησιμοποιώντας ένα ήπια όξινο ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης, επιτρέποντας τη συνέχιση της σύνθεσης DNA. Εφόσον τα dNTP τροποποιούνται μόνο στο 3′ άκρο, αποπροστατεύονται και δεν αφήνουν κανένα ίχνος τροποποίησης στο συντιθέμενο προϊόν. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν απευθείας σε ειδικούς χωρίς περαιτέρω επεξεργασία και είναι πανομοιότυπα με το φυσικό DNA.

Διαδικασία EDS 2 βημάτων
Η ενζυμική σύνθεση DNA (EDS) είναι μια διαδικασία δύο σταδίων [DNA Script]

Ροή εργασιών σύνθεσης

Τα ολίγο συντίθενται σε μια διαδικασία δύο σταδίων. Στο πρώτο βήμα το ένζυμο TdT επιμηκύνει το iDNA προσθέτοντας ένα μόνο νουκλεοτίδιο. Ακολουθεί αφαίρεση του αναστρέψιμου τερματιστή του προστιθέμενου νουκλεοτιδίου, αφήνοντας τον αναπτυσσόμενο κλώνο έτοιμο για ένα άλλο βήμα επιμήκυνσης. Αυτά τα δύο βήματα επαναλαμβάνονται μέχρι να επιτευχθεί το επιθυμητό μήκος. Τα προκύπτοντα ολίγο αφαλατώνονται, ποσοτικοποιούνται, κανονικοποιούνται και είναι έτοιμα για χρήση σε διαφορετικές εφαρμογές.

Τα ολιγονουκλεοτίδια απαιτούνται για σχεδόν κάθε σχεδιασμό μελέτης στη μοριακή βιολογία, τη γονιδιωματική και τις εφαρμογές της επιστήμης της ζωής. Η τεχνολογία EDS αναμένεται να φέρει επανάσταση στην έρευνα σε αυτούς τους τομείς, συμπεριλαμβανομένου του στοχευμένου NGS, της συναρμολόγησης γονιδίων και της παραγωγής εμβολίων με βάση το νουκλεϊκό οξύ.6 Με την τεχνολογία EDS, η σύνθεση DNA έχει εισέλθει σε ένα νέο στάδιο που θα μεταμορφώσει την έρευνα της βιοεπιστήμης και θα ανταμείψει τους ερευνητές με σημαντική ανεξαρτησία και έλεγχο στους χρόνους ολοκλήρωσης και την αποτελεσματικότητα της σύνθεσης.

βιβλιογραφικές αναφορές

  1. Beaucage SL, Caruthers MH. Δεοξυνουκλεοσιδικοί φωσφοραμιδίτες — Μια νέα κατηγορία βασικών ενδιάμεσων για τη σύνθεση δεοξυπολυνουκλεοτιδίων. Tetrahedron Lett. 1981, 22(20):1859-1862. doi:10.1016/S0040-4039(01)90461-7
  2. Eimerman P, Jeddeloh J, Champion Ε, et al. Ανάπτυξη ενός απλού και ευέλικτου ενζυματικού συστήματος σύνθεσης DNA που επιτρέπει την ακριβή, γρήγορη και μεγάλη διάρκεια ολιγονουκλεοτιδίων κατά παραγγελία. J Biomol Tech JBT. 2020; 31 (Παράρτημα): S10.
  3. Τεχνολογία. Σενάριο DNA. Πρόσβαση στις 20 Ιουνίου 2022.
  4. Delarue M, Boulé JB, Lescar J, et al. Κρυσταλλικές δομές μιας ανεξάρτητης από εκμαγείο πολυμεράσης DNA: τελική δεοξυνουκλεοτιδυλτρανσφεράση ποντικού. EMBO J. 2002, 21(3):427-439. doi:10.1093/emboj/21.3.427
  5. Motea EA, Berdis AJ. Τερματική δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράση: Η ιστορία μιας λανθασμένης πολυμεράσης DNA. Biochim Biophys Acta. 2010, 1804 (5): 1151-1166. doi:10.1016/j.bbapap.2009.06.030
  6. Εφαρμογές. Σενάριο DNA. Πρόσβαση στις 20 Ιουνίου 2022.