Δοκιμασίες θερμικής μετατόπισης για σύνθετα μοντέλα in vitro

Δοκιμασίες θερμικής μετατόπισης για σύνθετα μοντέλα in vitro

September 7, 2022 0 Von admin

Η δέσμευση ενός συνδέτη στην φυσική τρισδιάστατη διαμόρφωση μιας πρωτεΐνης αυξάνει τη σταθερότητα της πρωτεΐνης, με αντίστοιχη αύξηση στη θερμοκρασία τήξης της πρωτεΐνης. Αυτή η έμμεση μέτρηση της δέσμευσης συνδέτη μετράται σε μια δοκιμασία θερμικής μετατόπισης (TSA).1

Η δέσμευση των ενώσεων σε έναν στόχο καθαρισμένης πρωτεΐνης μπορεί να μετρηθεί χρησιμοποιώντας μια σειρά βιοχημικών ή βιοφυσικών δοκιμασιών, όπως η διαφορική φθορισμομέτρηση σάρωσης (DSF). Ωστόσο, αυτά τα μέτρα δεν μεταφράζονται πάντα σε δέσμευση στόχου σε ένα κυψελοειδές πλαίσιο. Στο DSF, η καθαρισμένη πρωτεΐνη αναμιγνύεται με μια περιβαλλοντικά ευαίσθητη χρωστική, της οποίας ο φθορισμός αυξάνεται με τη συγκέντρωση της μη διπλωμένης πρωτεΐνης στο μείγμα. Η ένταση φθορισμού της βαφής καταγράφεται ως συνάρτηση της θερμοκρασίας, με αποτέλεσμα μια καμπύλη τήξης πρωτεΐνης. Εκτελείται απουσία και παρουσία προσδεμάτων, υπολογίζεται μια θερμική μετατόπιση (ΔTm).1

Δοκιμασίες κυτταρικής θερμικής μετατόπισης

Η θερμική σταθεροποίηση που προκαλείται από συνδέτη λαμβάνει χώρα επίσης στο πλαίσιο του ενδοκυτταρικού περιβάλλοντος.1,2 Η δοκιμασία κυτταρικής θερμικής μετατόπισης (CETSA) είναι μια εύκολη και αποδεδειγμένη μέθοδος για την επίδειξη αλληλεπιδράσεων συνδέτη-πρωτεΐνης σε ζωντανά κύτταρα και μπορεί να χρησιμοποιηθεί χωρίς τροποποιήσεις στον συνδέτη ή την πρωτεΐνη. Η ανάλυση κέρδους σήματος παράγει ελάχιστα ψευδώς θετικά και μπορεί να εφαρμοστεί σε όλα τα στάδια της διαδικασίας ανακάλυψης φαρμάκου.2

Εννοιολογικά, όχι τόσο διαφορετικό από τα παραδοσιακά TSA, το CETSA μπορεί να εκτελεστεί σε μορφές υψηλής απόδοσης, βασισμένες σε μικροπλάκες για να επιτρέψει την ευρύτερη εφαρμογή σε εκστρατείες πρώιμης ανακάλυψης φαρμάκων. Για να αποδείξει πόσο καλά το CETSA συσχετίζεται με πιο καθιερωμένη και συμβατική κυτταρική και βιοχημική TSA προσεγγίζει ο Shaw et al. ανέφεραν δύο νέες δοκιμές υψηλής απόδοσης CETSA (CETSA HT) για πρωτοογκογονίδιο B-Raf και την πολυμεράση PARP1. Συγκριτικές αναλύσεις με άλλες αναλύσεις έδειξαν ότι το CETSA HT συσχετίζεται καλά με άλλες τεχνολογίες διαλογής.3

Τα σύνολα δεδομένων CETSA, ειδικά όταν συνδυάζονται με άλλες μορφές ανάλυσης, μπορούν να βοηθήσουν στη δημιουργία μιας πολύ σαφέστερης εικόνας για το πώς οι στόχοι διαμορφώνουν πολύπλοκα συστήματα. Στον προσδιορισμό, τα ζωντανά κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με ενώσεις δοκιμής και εφαρμόζεται ένα σύντομο παροδικό θερμικό σοκ. Τα κύτταρα στη συνέχεια λύονται και τα επίπεδα της θερμοσταθερής πρωτεΐνης στόχου ποσοτικοποιούνται.2

Σε ένα άλλο σύνολο πειραμάτων, ο Shaw και η ομάδα χρησιμοποίησαν western blots για να δείξουν σταθερότητα του υποδοχέα ανδρογόνων όταν δεσμεύεται σε ζωντανά κύτταρα. Οι κηλίδες Western μπορούν να ποσοτικοποιηθούν για να καταδειχθεί η θερμική μετατόπιση ως ένδειξη εμπλοκής στόχου. Αλλά ομοιογενείς προσεγγίσεις που βασίζονται σε σφαιρίδια, όπως η τεχνολογία PerkinElmer Alpha CETSA, μπορούν επίσης να εφαρμοστούν για τον ποσοτικό προσδιορισμό της θερμικά σταθερής πρωτεΐνης στόχου.4 Αυτή η ανάλυση υψηλής απόδοσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ποσοτικοποίηση της σχέσης δραστηριότητας δομής (SAR) έναντι μιας ολόκληρης χημικής σειράς για συσχέτιση με άλλα σύνολα δεδομένων.2

Παραδείγματα in vitro

Σε μια ποσοτική προσέγγιση, τα κύτταρα μπορούν να υποβληθούν σε επεξεργασία με μια σειρά συγκεντρώσεων της υπό εξέταση ένωσης. Στη συνέχεια, εφαρμόζεται ένα μόνο θερμικό σοκ σε μια σταθερή θερμοκρασία σε όλα τα δείγματα για τη μέτρηση μιας σχετικής EC50 ως εκτίμηση της ισχύος της δέσμευσης του στόχου στα κύτταρα.2

Το PARP1 είναι ένας καλά εδραιωμένος στόχος για μια σειρά διαφορετικών καρκίνων. Όταν ένα σχετικό κυτταρικό υπόβαθρο υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικούς αναστολείς PARP1 και χρησιμοποιήθηκε ένα τελικό σημείο άλφα για τον ποσοτικό προσδιορισμό του PARP1, μια θερμική μετατόπιση έδειξε στοιχεία εμπλοκής στόχου, αλλά δεν διαφοροποίησε τους αναστολείς. Όλοι έδεσαν το PARP1. Εκτελώντας μια ισοθερμική απόκριση δόσης με θερμικό σοκ 49°C, προσδιορίστηκε ένα μέτρο ισχύος για αυτές τις ενώσεις και μετρήθηκε ως EC50 να διαφοροποιήσουν τις ενώσεις με βάση την ισχύ με την οποία συνέδεσαν το PARP1.2, 3 Είναι σημαντικό ότι τα αποτελέσματα έδειξαν όπου η δέσμευση πρωτεΐνης δεν οδηγεί σε δέσμευση στα κύτταρα και όταν η δέσμευση στα κύτταρα δεν οδηγεί σε λειτουργική αναστολή του στόχου.2

Ένα άλλο παράδειγμα χρησιμοποιεί το ROS1, έναν υποδοχέα κινάσης τυροσίνης που εμπλέκεται σε χρωμοσωμικές ανακατατάξεις στις πρωτεΐνες σύντηξης και υπεύθυνος για την οδήγηση υποσυνόλων μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα. Το ROS1 μπορεί να σχηματίσει μια σειρά διαφορετικών συντήξεων όπου οι πρωτεΐνες σύντηξης ενώνονται με μια άλλη πρωτεΐνη. Εξερευνήθηκε μια σειρά αναστολέων έναντι αυτής της σύντηξης.2 Η δραστικότητα μετρήθηκε έναντι της απομονωμένης περιοχής κινάσης και η λειτουργική δραστηριότητα έναντι της πρωτεΐνης σύντηξης εντός του κυτταρικού υποβάθρου HCC78.

Χρησιμοποιώντας σύνολα δεδομένων Alpha CETSA, οι ερευνητές απέδειξαν ότι η δέσμευση στην πρωτεΐνη σύντηξης μεταφράζεται σε δέσμευση με την πρωτεΐνη στα κυτταρολύματα και με τη σειρά της σε ζωντανά κύτταρα. Αλλά οι συσχετίσεις μπορεί να είναι λιγότερο σαφείς – η δραστηριότητα στα κύτταρα και η δέσμευση στόχου μπορεί να διαφέρουν σε σύγκριση με τις αναλύσεις σε καθαρισμένη πρωτεΐνη.2

βιβλιογραφικές αναφορές

    1. Shaw J and Stubbs C. Έμμεση ανίχνευση σύνδεσης προσδέματος με ανάλυση θερμικής τήξης. Η Tina Daviter et al. (επιμ.), Protein-Ligand Interactions: Methods and Applications, 2021, Μέθοδοι στη Μοριακή Βιολογίατ. 2263, DOI:10.1007/978-1-0716-1197-5_8
    2. Cellular Thermal Shift Assays – φέρνοντας σχετικό στόχο στο διαδικτυακό σεμινάριο ροής εργασιών ανακάλυψης φαρμάκων. Χορηγός της PerkinElmer και της Pelago Bioscience. Ανασκόπηση στόχου φαρμάκων. 2021. https://www.drugtargetreview.com/webinar/90745/cellular-thermal-shift-assays-bringing-relevant-target-engagement-to-your-drug-discovery-workflow/
    3. Shaw J, et αϊ. Τοποθέτηση του CETSA υψηλής απόδοσης στην πρώιμη ανακάλυψη φαρμάκων μέσω του Screening έναντι του B-Raf και του PARP1. SLAS Discovery 2019, Τόμος 24(2) 121–132. DOI: 10.1177/2472555218813332
    4. Shaw J, et αϊ. Προσδιορισμός άμεσων συνδετικών ουσιών του υποδοχέα ανδρογόνων χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία κυτταρικής θερμικής μετατόπισης υψηλής απόδοσης ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΕΣ ΕΚΘΕΣΕΙΣ2018, 8:163, DOI:10.1038/s41598-017-18650-x