Μια ολοκληρωμένη προσέγγιση για την ανίχνευση παροδικών πρωτεϊνικών δομών σε κυτταρικά εκχυλίσματα

By Panagiotis L. Kastritis, PhD

Για να λειτουργήσουν σωστά, οι κυτταρικές πρωτεΐνες εξαρτώνται όχι μόνο από τις πολύπλοκες τριτοταγείς και τεταρτοταγείς δομές τους, αλλά και από την εγγύτητα και τις αλληλεπιδράσεις τους με άλλα μόρια που συμμετέχουν στην ίδια μεταβολική ή ενζυμική οδό. Ο χαρακτηρισμός τέτοιων τοπογραφικών και αλληλεπιδράσεων είναι ζωτικής σημασίας για την πλήρη κατανόηση της κυτταρικής λειτουργίας και δυσλειτουργίας.

Αλλά η οπτικοποίηση και ο χαρακτηρισμός των αλληλεπιδράσεων φυσικής πρωτεΐνης-πρωτεΐνης παραμένει μια πρόκληση, κυρίως λόγω της πολυπλοκότητας και του μεγέθους των πρωτεϊνικών δομών εντός του κυττάρου. Μέχρι σήμερα, οι περισσότερες γνώσεις για τη λειτουργία των πρωτεϊνών προέρχονται από αναλυτικές τεχνικές που καταστρέφουν τη δομή πρωτεϊνών ανώτερης τάξης και διαταράσσουν τις χωρικές ρυθμίσεις που είναι ζωτικής σημασίας για την αποτελεσματική λειτουργία.

Ευτυχώς, μια νέα εποχή για την κυτταρική και δομική βιολογία έχει ανατείλει. Νέες τεχνικές προετοιμασίας δειγμάτων σε συνδυασμό με την εμφάνιση της κρυογονικής ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (cryo-EM) και την πρόοδο σε συμπληρωματικές τεχνικές, όπως η φασματομετρία μάζας (MS), σημαίνει ότι είναι πλέον δυνατή η οπτικοποίηση και η ανάκριση μεγάλων πρωτεϊνικών συμπλεγμάτων σε σχεδόν φυσική κατάσταση. Ήδη, οι τεχνολογικές και υπολογιστικές πρόοδοι έχουν δημιουργήσει μια έκρηξη δεδομένων για τη δομή και τη λειτουργία των πρωτεϊνών.

Νέες ολοκληρωμένες μέθοδοι επιτρέπουν μια ολιστική προσέγγιση στη δομική βιολογία. Κατά συνέπεια, μπορούν τώρα να αποκαλυφθούν παροδικά ικριώματα και υπομονάδες που δεν ήταν ανιχνεύσιμες, βελτιώνοντας τις γνώσεις μας για την υπερδομή του κυττάρου και προσφέροντας νέες οδούς για την ανακάλυψη φαρμάκων.

Μια νέα προοπτική στην αρχιτεκτονική πρωτεϊνών

Η κυτταρική αρχιτεκτονική και η στοιχειομετρία πρωτεϊνών είναι ζωτικής σημασίας για τη σωστή λειτουργία των κυττάρων, ωστόσο οι μηχανικές και χημικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται συνήθως για την απομόνωση κυτταρικών πρωτεϊνών διαταράσσουν μια μυριάδα λεπτώς ελεγχόμενων αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνικών υπομονάδων και συμπλεγμάτων. Η έρευνα για την εξερεύνηση των καταλυτικών μονοπατιών είναι συχνά αναγωγική—προσδιορίζοντας μεμονωμένα συστατικά πριν από την προσθήκη καθαρισμένων συστατικών μαζί, κυρίως μετά από ετερόλογη έκφραση, για τον έλεγχο και την παρακολούθηση των αλληλεπιδράσεων.

Μια νέα, πιο ολιστική προσέγγιση παρέχει μια νέα προοπτική. Χρησιμοποιεί εκχυλίσματα κυττάρων για να διατηρήσει τα πρωτεϊνικά σύμπλοκα ανέπαφα και σε φυσική εγγύτητα με άλλες πρωτεΐνες, επιτρέποντας στους επιστήμονες να μελετήσουν την αρχιτεκτονική και την οργάνωση πρωτεϊνών ανώτερης τάξης. Τα εκχυλίσματα μπορούν να διερευνηθούν χρησιμοποιώντας μια σειρά από οπτικοποιήσεις αιχμής, αναλυτικές και λειτουργικές δοκιμασίες, πολλές από τις οποίες επιτρέπουν τη μελέτη των πρωτεϊνών σε φυσική κατάσταση.

Τα δεδομένα που παράγονται χρησιμοποιώντας καινοτόμες τεχνικές, όπως το κρυο-ΕΜ για την οπτικοποίηση πρωτεϊνών και τη διασύνδεση MS (XL-MS) για τον εντοπισμό και τον χαρακτηρισμό τους, συμπληρώνονται από πληροφορίες από λειτουργικές δοκιμασίες και προηγμένη υπολογιστική βιολογία για να αποκαλύψουν λεπτομέρειες περίπλοκων αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης που δεν είχαν εμφανιστεί στο παρελθόν. μέσα στο κελί. Αυτή η ολοκληρωμένη προσέγγιση, που τροφοδοτείται περαιτέρω από τον τεχνολογικό και ψηφιακό αυτοματισμό, προωθεί τα σύνορα της κυτταρικής βιολογίας και της κλασικής δομικής βιολογίας.

Αποκαλύφθηκαν νέα δομικά και μη δομικά στοιχεία

Τα οφέλη αυτής της προσέγγισης ολοκληρωμένης δομικής βιολογίας μπορούν να απεικονιστούν από το σύμπλεγμα πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης (PDHc), το οποίο είναι ένα γιγαντιαίο ενζυματικό συγκρότημα 10 megadalton, πανταχού παρόν σε ευκαρυωτικά κύτταρα, το οποίο μετατρέπει το πυροσταφυλικό σε ακετυλοσυνένζυμο Α. Έχουν χαρακτηριστεί πολλαπλά συστατικά PDHc σε απομόνωση και εντοπισμένη στη διεπιφάνεια μιτοχονδριακής εσωτερικής μεμβράνης-μήτρας, αλλά η τεταρτοταγής δομή του συμπλέγματος έχει παραμείνει ασαφής λόγω του τεράστιου μεγέθους, της ετερογένειας και της πλαστικότητάς του.
Παραδόξως, προηγούμενες μελέτες έχουν εντοπίσει δομικά συστατικά που επικαλύπτουν τη θέση δέσμευσης πυροσταφυλικού, εγείροντας το ερώτημα για το πώς το υπόστρωμα εισέρχεται και δεσμεύεται αποτελεσματικά στη θέση.

Πρόσφατα, οι ερευνητές ακολούθησαν μια πιο ολιστική προσέγγιση για να κατανοήσουν καλύτερα τη δομική οργάνωση της PDHc (Φιγούρα 1). Εμπλούτισαν εκχυλίσματα κυττάρων από θερμόφιλο μύκητα και χρησιμοποίησαν μια σειρά αναλυτικών δοκιμασιών, συμπεριλαμβανομένων των MS και cryo-EM, για να αποκαλύψουν, για πρώτη φορά, την ενεργή δομή του πανταχού παρόντος PDHc.¹

Μεγάλα πρωτεϊνικά σύμπλοκα, που απομονώθηκαν από κυτταρολύματα χρησιμοποιώντας χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους (SEC), οπτικοποιήθηκαν σε ατομικό επίπεδο χρησιμοποιώντας κρυο-ΕΜ και η σύνθεσή τους προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τεχνικές MS. Το Chemical XL-MS, το οποίο χρησιμοποιεί χημικές ουσίες για τη σταθεροποίηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης πριν από την ανάλυση MS, βοήθησε στον εντοπισμό των αλληλεπιδράσεων στα συγκροτήματα πρωτεΐνης.

Η σύνδεση των δεδομένων MS που προκύπτουν με μοριακές υπογραφές που προσδιορίζονται σε μικρογραφίες κρυο-ΕΜ έχει αποκαλύψει μια πληθώρα δομών, συμπεριλαμβανομένου του μεταβολισμού της συνθάσης λιπαρών οξέων, δομών διπλής και μονής μεμβράνης, λιποσωμάτων με ενθυλακωμένα βιομόρια και άλλα σύμπλοκα ανώτερης τάξης.²

Αυτή η ολοκληρωμένη προσέγγιση παρείχε νέες ιδέες για την τρισδιάστατη δομή της θέσης δέσμευσης PDHc και απέδειξε για πρώτη φορά ότι είναι προσβάσιμη στο υπόστρωμα πυροσταφυλικού άλατος. Αυτή η προσέγγιση αποκάλυψε επίσης μια ασύμμετρη διαμόρφωση πρωτεΐνης που εμπλέκεται άμεσα στην οξείδωση πυροσταφυλικού.¹

Η μεγάλη αποκάλυψη ήρθε όταν οπτικοποιήθηκε για πρώτη φορά ένα γιγάντιο νανοδιαμέρισμα – ένας παροδικός καταλυτικός θάλαμος που ονομάζεται «εργοστάσιο αφυδρογονάσης πυροσταφυλικού άλατος». Είναι πιθανό να είναι η πρώτη από πολλές παρόμοιες δομές που εντοπίστηκαν χρησιμοποιώντας αυτές τις μεθόδους (Σχήμα 2).

Αλλαγή της διεπαφής για κυτταρική και δομική βιολογία

Τεχνολογίες, όπως το MS και το cryo-EM, συνεχίζουν να προχωρούν με ρυθμό, μαζί με λειτουργικές και βιοφυσικές αναλύσεις. Επιπλέον, τα εργαλεία αυτοματισμού και μηχανικής μάθησης έχουν αυξήσει την απόδοση και την αποτελεσματικότητα και έχουν οδηγήσει σε έκρηξη στα σύνολα δεδομένων που επιτρέπουν στους ερευνητές να έχουν μια πολύ ευρύτερη άποψη περίπλοκων αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών. Η δημιουργία μεγάλων συνόλων δεδομένων καθιστά δυνατή την εξόρυξη διανομών δεδομένων αντί για μεμονωμένα σημεία δεδομένων. Επιπλέον, τα μεγάλα σύνολα δεδομένων παρέχουν στους ερευνητές νέες ευκαιρίες για να διερευνήσουν τις κυτταρικές διεργασίες και να εντοπίσουν σημεία για παρέμβαση.

Επιπλέον, οι αλγόριθμοι εμπνευσμένοι από τη μηχανική μάθηση ενισχύουν τις ροές εργασίας επεξεργασίας εικόνας για να επιταχύνουν τις αναλύσεις χιλιάδων αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών.³ Αυτή η προσέγγιση υψηλής ανάλυσης και υψηλής απόδοσης αποκαλύπτει ξεχωριστές δομικές υπογραφές. Αυτές οι υπογραφές μπορούν να συσχετιστούν με πρωτεομικά δεδομένα και χάρτες κρυο-ΕΜ για τον χαρακτηρισμό πρωτεϊνικών κοινοτήτων που δεν είχαν ταυτοποιηθεί προηγουμένως σε υψηλή ανάλυση.

Είναι αυτή η ολοκληρωμένη προσέγγιση που παρέχει νέες γνώσεις για τη μοριακή οργάνωση σε σχεδόν ατομική κλίμακα και αποκαλύπτει νέες αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης που είναι ζωτικής σημασίας για τη σωστή λειτουργία των κυττάρων.⁴ Αναμφίβολα, αυτές οι ιδέες θα οδηγήσουν την ανακάλυψη φαρμάκων πέρα ​​από την ενεργό θέση ενός ενζύμου σε άλλα συγκεκριμένα σημεία αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών.

Νέοι ορίζοντες για την ανακάλυψη ναρκωτικών

Υπάρχουν ακόμη πολλά να μάθουμε για το πρωτεόμιο του κυττάρου και την ακριβή αρχιτεκτονική του. Η συγκέντρωση ενός συνδυασμού βιολογικών και βιοφυσικών αναλύσεων σε ένα ολοκληρωμένο μοντέλο, χρησιμοποιώντας εκχυλίσματα κυττάρων και καθαρισμένα μόρια, παρέχει τεράστιες δυνατότητες για την επίλυση των πιο απαιτητικών ερωτημάτων σχετικά με τη δομή και τη λειτουργία των κυττάρων.

Η ολοκληρωμένη προσέγγιση προσφέρει μια γέφυρα συνδυασμού δεδομένων για καθαρισμένες πρωτεΐνες και υπομονάδες με οπτικά και αναλυτικά δεδομένα σε μεγαλύτερα σύμπλοκα στη φυσική τους κατάσταση, σε μια πρωτοφανή ανάλυση.

Για πρώτη φορά, παροδικές πρωτεϊνικές δομές που είναι ζωτικής σημασίας για την ενζυμική δραστηριότητα μπορούν να οπτικοποιηθούν και να διερευνηθούν. Και ο αυτοματισμός και η μηχανική μάθηση μεταμορφώνουν την κλίμακα και τον ρυθμό με τον οποίο μπορούν να αποκτηθούν νέες γνώσεις, όπως μαρτυρήθηκε πρόσφατα με τα έργα AlphaFold και RoseTTAFold για την πρόβλεψη τρισδιάστατων δομών πρωτεϊνών και τις αλληλεπιδράσεις τους.

Όλα αυτά παρέχουν έμπνευση για νέους δρόμους έρευνας. Αλλά για να ωθήσουν τις τεχνολογίες στα όρια, οι ερευνητές πρέπει να συνεργαστούν και να αναπτύξουν ένα συνεκτικό μοντέλο που μπορεί να εφαρμοστεί σε εργαστήρια και να χρησιμοποιηθεί από ερευνητές σε διαφορετικούς κλάδους.

Μέσα σε μια δεκαετία, τα κομμάτια του κυτταρικού παζλ θα πρέπει να είναι στη θέση τους. Ένας πλήρης κατάλογος δομών κυτταρικών πρωτεϊνών είναι ορατό και ολοκληρωμένα δεδομένα σχετικά με τον τρόπο λειτουργίας και οργάνωσης του κυττάρου βρίσκονται στον ορίζοντα. Ουσιαστικά, η ευρεία εφαρμογή μιας ολοκληρωμένης αναλυτικής προσέγγισης, με χρήση σύγχρονων και αναδυόμενων τεχνολογιών, είναι απαραίτητη για να υποστηρίξει αυτή την έκρηξη στη γνώση και να επιταχύνει και να διευρύνει το πεδίο της ανακάλυψης ναρκωτικών στα επόμενα χρόνια.

βιβλιογραφικές αναφορές
1. Kyrilis FL, Semchonok DA, Skalidis I, et al. Ενσωματωμένη δομή ενός συμπλόκου ευκαρυωτικής πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης 10-megadalton από εκχυλίσματα φυσικών κυττάρων. Cell Rep. 2021; 34: 108727. DOI: 10.1016/j.celrep.2021.108727.
2. Σκαλίδης Ι, Tüting C, Καστρίτης Π.Λ. Μη δομημένες περιοχές μεγάλων ενζυματικών συμπλεγμάτων ελέγχουν τη διαθεσιμότητα μεταβολιτών με λειτουργίες σηματοδότησης. Cell Commun. Σήμα. 2020; 18(1): 136. DOI: 10.1186/s12964-020-00631-9
3. Kyrilis FL, Belapure J, Kastritis PL. Ανίχνευση κοινοτήτων πρωτεϊνών σε εκχυλίσματα εγγενών κυττάρων με μηχανική μάθηση: Η προοπτική ενός δομικού βιολόγου. Εμπρός. ΜοΙ. Biosci. 2021; 8: 660542. DOI: 10.3389/fmolb.2021.660542.
4. Tüting C, Kyrilis FL, Müller J, et al. Τα στιγμιότυπα Cryo-EM ενός φυσικού λύματος παρέχουν δομικές γνώσεις για μια αντίδραση τρανσακετυλάσης ενσωματωμένη σε μεταβολισμό. Nat. Commun. 2021; 12: 6933. DOI: 10.1038/s41467-021-27287-4.

Panagiotis L. Kastritis, PhD ([email protected]), is κατώτερος καθηγητής κρυοηλεκτρονικής μικροσκοπίας και υπολογιστικής δομικής βιολογίας στο Διεπιστημονικό ερευνητικό κέντρο HALOmem, Charles Tanford Protein Center Institute of Biochemistry and BiotechnologyΠανεπιστήμιο Martin Luther Halle-Wittenberg, Γερμανία.