Ο χαρακτηρισμός αντισωμάτων αντιμετωπίζει την ευθύνη αντισωμάτων

Ο χαρακτηρισμός αντισωμάτων αντιμετωπίζει την ευθύνη αντισωμάτων

September 21, 2022 0 Von admin

Το 2015, μια ανάλυση έδειξε ότι ο συνολικός επιπολασμός της μη αναπαραγώγιμης προκλινικής έρευνας ξεπέρασε το 50%, με αποτέλεσμα να δαπανώνται περίπου 28 δισεκατομμύρια δολάρια ετησίως για προκλινική έρευνα που δεν μπορεί να αναπαραχθεί—μόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες.1 Την ίδια χρονιά, α Φύση άρθρο ειδήσεων επεσήμανε τα μη επικυρωμένα αντισώματα ως κύριο μοχλό αυτής της «κρίσης αναπαραγωγιμότητας».2

Αν και τα αντισώματα αποτελούν βασικό πόρο στη βιοϊατρική έρευνα, δεν υπάρχουν πρότυπα αποδεκτά από την κοινότητα που να χαρακτηρίζουν αυστηρά την ποιότητά τους. Το 2019, οι Laflamme et al. ανέπτυξε μια διαδικασία για την επικύρωση των υπαρχόντων αντισωμάτων εστιάζοντας αρχικά στο κύριο προϊόν γονιδίου της νόσου της αμυοτροφικής πλευρικής σκλήρυνσης (ALS), C9ORF72. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το αντίσωμα που αναφέρεται ή χρησιμοποιείται περισσότερο στις περισσότερες μελέτες δεν είναι ειδικό για το C9ORF72 και ότι τα καλύτερα αντισώματα για κάθε έναν από τους προσδιορισμούς χαρακτηρισμού δεν είχαν εμφανιστεί ποτέ στη βιβλιογραφία.3

Έτσι, δημιουργήθηκε η YCharOS Inc., μια συνεργασία μεταξύ του εργαστηρίου του Peter McPherson, PhD, του Νευρολογικού Ινστιτούτου-Νοσοκομείου του Μόντρεαλ (The Neuro) στο Πανεπιστήμιο McGill και του Structural Genomics Consortium (SCG), μιας συνεργασίας δημόσιου και ιδιωτικού τομέα με έδρα την Ευρώπη. , τις Ηνωμένες Πολιτείες και τον Καναδά. Αυτός ο οργανισμός ανοιχτής επιστήμης πραγματοποιεί παράπλευρες συγκρίσεις εμπορικά διαθέσιμων αντισωμάτων για την ίδια πρωτεΐνη-στόχο και δημοσιεύει τα αποτελέσματα για χρήση από επιστήμονες παγκοσμίως.

Χαρακτηρισμός αντισωμάτων

Έχουν προταθεί διάφορες μέθοδοι χαρακτηρισμού αντισωμάτων.4 «Εμείς και άλλοι, συμπεριλαμβανομένων των κατασκευαστών αντισωμάτων, έχουμε αποδείξει ότι η γενετική προσέγγιση είναι η πιο αυστηρή επιστημονικά». 5 είπε ο Carl Laflamme, PhD, επικεφαλής του έργου στο SGC Neuro.

«Αφαιρούμε τον επιδιωκόμενο πρωτεϊνικό στόχο αναστέλλοντας γενετικά την έκφραση γονιδίων χρησιμοποιώντας την τεχνολογία επεξεργασίας γονιδίων CRISPR-Cas9. Αυτές οι κυτταρικές σειρές νοκ-άουτ (ΚΟ) χρησιμοποιούνται στη συνέχεια ως ιδανικός αρνητικός έλεγχος για μελέτες χαρακτηρισμού αντισωμάτων. Ένα αντίσωμα είναι ειδικό για τον επιδιωκόμενο πρωτεϊνικό στόχο εάν παρατηρηθεί πλήρης έλλειψη σήματος στις κυτταρικές σειρές ΚΟ που έχουν χρωματιστεί με το αντίσωμα.»

Το YCharOS έχει χαρακτηρίσει σχεδόν 400 αντισώματα χρησιμοποιώντας κυτταρικές σειρές KO. Μια αντιπροσωπευτική αναφορά χαρακτηρισμού για Συνταξίνη-4 δείχνει τις λεπτομέρειες. Ορισμένοι κατασκευαστές αντισωμάτων παρέχουν επίσης δεδομένα χαρακτηρισμού KO. Όταν είναι δυνατόν, το YCharOS εστιάζει σε ανανεώσιμα αντισώματα, μονοκλωνικά ή ανασυνδυασμένα. Σε ορισμένες περιπτώσεις, για «σκοτεινές» πρωτεΐνες με λίγες μόνο καταχωρήσεις PubMed, μπορεί να είναι διαθέσιμα μόνο πολυκλωνικά.

Αντιστοίχιση του αντιδραστηρίου με την εφαρμογή

Η Laflamme συνιστά στους ερευνητές να επικυρώσουν το εμπορικό τους αντίσωμα στο κυτταρικό τους σύστημα και την εφαρμογή που τους ενδιαφέρει.

Τα αντισώματα είναι εννοιολογικά κατάλληλα για το σκοπό αντιδραστήρια. Αναγνωρίζουν ένα χαρακτηριστικό της πρωτεΐνης στόχου, όπως μια τρισδιάστατη δομή, αλλά ανάλογα με την ερευνητική εφαρμογή που χρησιμοποιείται, οι πρωτεΐνες υφίστανται διαφορετικές επεξεργασίες. Αυτές οι θεραπείες μπορούν να μετουσιώσουν πλήρως τις πρωτεΐνες, να διασυνδέσουν πρωτεΐνες μεταξύ τους ή να διατηρήσουν τη φυσική τους δομή. «Τα αντισώματα πιστεύεται ότι λειτουργούν σε συγκεκριμένες εφαρμογές ανάλογα με την ικανότητά τους να αναγνωρίζουν μετουσιωμένα ή δομημένα χαρακτηριστικά», είπε ο Laflamme. „Ωστόσο, έχουμε μερικά ενδιαφέροντα προκαταρκτικά δεδομένα που αμφισβητούν αυτήν την ιδέα.“

Σχεδόν το 90% των αντισωμάτων που είχαν καλή απόδοση σε μελέτες ανοσοφθορισμού είχαν επίσης καλή απόδοση σε στυπώματα western, κάτι που είναι αντίθετο επειδή η δομή της πρωτεΐνης διαφέρει στις δύο εφαρμογές. Η ίδια σχέση ισχύει για τα αντισώματα που είχαν καλή απόδοση σε πειράματα ανοσοκατακρήμνισης. είχαν επίσης καλή απόδοση σε western blots (μη δημοσιευμένα δεδομένα).

«Συνήθως πιστεύαμε ότι ένα αντίσωμα δεν θα αναγνώριζε τόσο μια γραμμική διαμόρφωση όσο και έναν καλά δομημένο επίτοπο», είπε ο Laflamme. «Και παρόλο που θα περίμενε κανείς μια συσχέτιση μεταξύ της απόδοσης στον ανοσοφθορισμό και της ανοσοκατακρήμνισης, αυτό δεν ισχύει».

Επιλογή κυτταρικής γραμμής

Η έκφραση πρωτεΐνης μπορεί να επηρεάσει την απόδοση των αντισωμάτων, επομένως, μια σημαντική παράμετρος είναι η επιλογή μιας κυτταρικής σειράς που εκφράζει στόχο για την έναρξη των μελετών χαρακτηρισμού.3 «Οι ερευνητές πρέπει να επιβεβαιώσουν την έκφραση και την αφθονία των πρωτεϊνών στο δικό τους κυτταρικό σύστημα σε σύγκριση με τα κύτταρα που χρησιμοποιήσαμε», δήλωσε ο Laflamme.

Η επιλογή μιας βέλτιστης κυτταρικής γραμμής μπορεί να είναι δύσκολη. Μια χρήσιμη ανοιχτή βάση δεδομένων που δημιουργήθηκε από το Broad Institute, το DepMap Portal, παρέχει δεδομένα RNA και πρωτεϊνική καραμπίνα για περισσότερες από 400 κυτταρικές σειρές. Αλλά ακόμη και αυτός ο πόρος δεν εντοπίζει πάντα κυτταρικές σειρές που εκφράζουν υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης στόχου. Το YCharOS έχει δει μια φτωχή συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης πρωτεΐνης και των επιπέδων RNA.

«Η εκτέλεση του western blot της παλιάς σχολής σε προϊόντα λύσης διαφορετικών κυτταρικών γραμμών εξακολουθεί να είναι ο καλύτερος τρόπος για τον εντοπισμό της πιο σχετικής κυτταρικής σειράς υψηλής έκφρασης», συμβουλεύει ο Laflamme.

Αναγνωριστικά πόρων

Αναγνωριστικά ερευνητικών πόρων (#RRID) είναι αριθμοί ταυτότητας που εκχωρούνται για να βοηθήσουν τους ερευνητές να αναφέρουν βασικούς πόρους στη βιοϊατρική βιβλιογραφία για τη βελτίωση της διαφάνειας και είναι απαραίτητοι για να επιτρέπουν τον έλεγχο μεγάλης κλίμακας ερευνητικών άρθρων.

«Έχουμε παρατηρήσει ότι ο ίδιος αριθμός καταλόγου μπορεί να χρησιμοποιηθεί από διαφορετικές εταιρείες για διαφορετικά αντισώματα, για παράδειγμα το mAb1234 από τον προμηθευτή Α και το mAb1234 από τον προμηθευτή Β μπορεί να είναι αντισώματα σε δύο διαφορετικές πρωτεΐνες. Αυτά τα δύο αντισώματα θα έχουν μοναδικά RRID. Τα RRID εντοπίζουν επίσης βασικά αντισώματα που έχουν διασταυρωθεί με άδεια μεταξύ διαφορετικών εταιρειών, βοηθώντας τους ερευνητές να αποφύγουν να αγοράσουν τα ίδια αντισώματα δύο φορές», τονίζει ο Laflamme.

Ο χαρακτηρισμός αντισωμάτων μπορεί να αυξήσει τη διαφάνεια στην προκλινική έρευνα και χρησιμοποιείται για να βοηθήσει στην αντιμετώπιση της «κρίσης αναπαραγωγιμότητας».

βιβλιογραφικές αναφορές

  1. Freedman LP, Cockburn IM, Simcoe TS (2015) The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLoS Biol 13(6): e1002165. DOI:10.1371/journal.pbio.1002165
  2. Baker M (2015) Κατηγορήστε το στα Αντισώματα. Φύση, Τόμος 521, 274-276
  3. Οι Laflamme et al., eLife 2019; 8: e48363. DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.48363
  4. Uhlen, Μ., et al., Μια πρόταση για επικύρωση αντισωμάτων. Μέθοδοι Nat, 2016. 13(10): σελ. 823-7 DOI: 10.1038/nmeth.3995
  5. Laflamme, C., et al., Γνώμη: Ανεξάρτητες οντότητες τρίτων ως μοντέλο για επικύρωση εμπορικών αντισωμάτων. Ν Biotechnol, 2021. 65: σελ. 1-8 DOI: 10.1016/j.nbt.2021.07.001