Συμβουλές σύζευξης αντισωμάτων

Συμβουλές σύζευξης αντισωμάτων

September 20, 2022 0 Von admin

Ένα συζευγμένο ή επισημασμένο αντίσωμα είναι ένα πολυκλωνικό ή μονοκλωνικό αντίσωμα με ένα προσαρτημένο μόριο αναφοράς που δημιουργεί ένα σήμα μέσω χρώματος, φθορισμού, ραδιενέργειας ή ενζυματικής δραστηριότητας, το οποίο μπορεί να ανιχνευθεί και να μετρηθεί.

Εάν σκοπεύετε να συζεύξετε το αντίσωμά σας, η ποιότητα και η καθαρότητα του αρχικού αντισώματος είναι κρίσιμες. Βεβαιωθείτε ότι έχει αποθηκευτεί σε κατάλληλη συγκέντρωση για διατήρηση της δραστηριότητας. Σύμφωνα με τη Novus Biologicals, το ρυθμιστικό διάλυμα αποθήκευσης θα πρέπει να είναι απαλλαγμένο από αμίνες (π.χ. PBS, HEPES ή MOPS) και χωρίς συστατικά όπως BSA, αζίδιο του νατρίου, γλυκίνη ή τρις, καθώς αυτά μπορούν να σβήσουν ορισμένες αντιδράσεις επισήμανσης.

Προσάρτηση του συζυγούς

Σε ένα Πρωτόκολλο Cold Spring Harbor1, οι Berg και Fishman εξηγούν ότι οι περισσότερες στρατηγικές επισήμανσης αντισωμάτων χρησιμοποιούν έναν από τους τέσσερις τρόπους σύνδεσης ενός μικρού μορίου σε ένα αντίσωμα. Για την επισήμανση ή για τη διασύνδεση βιομορίων, οι κύριες θέσεις που χρησιμοποιούνται είναι τα φορτισμένα αμινοξέα που βρίσκονται στις εξωτερικές επιφάνειες των αντισωμάτων.

Οι πρωτοταγείς αμίνες είναι συχνά οι στόχοι για τη χημεία σύζευξης επειδή είναι άφθονες, ευρέως κατανεμημένες και τροποποιούνται εύκολα λόγω της αντιδραστικότητάς τους. Αλλά συχνά εμπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης που είναι απαραίτητες για τη λειτουργία του αντισώματος. Επομένως, η χημική τους τροποποίηση μπορεί να επηρεάσει και να μειώσει σημαντικά τη δράση δέσμευσης αντιγόνου του αντισώματος.

Ένας δεύτερος στόχος είναι τα τμήματα υδατανθράκων που βρίσκονται στη συχνά εξαιρετικά γλυκοζυλιωμένη ουρά του αντισώματος που ονομάζεται κρυσταλλώσιμο ή Fc θραύσμα του αντισώματος, τα οποία βρίσκονται σε απόσταση από τις θέσεις αναγνώρισης αντιγόνου. Επομένως, αυτή η επισήμανση είναι λιγότερο πιθανό να παρεμβαίνει στη δέσμευση αντιγόνου. Άλλοι στόχοι περιλαμβάνουν το τμήμα σουλφυδρυλίου που περιέχεται στα υπολείμματα κυστεΐνης και τα υπολείμματα τυροσίνης που μπορούν να ιωδιωθούν ειδικά (π.χ. 125I) για τη ραδιοσήμανση του αντισώματος.

Πολλές μέθοδοι σύζευξης αντισωμάτων χρησιμοποιούν χημικούς διασυνδέτες για να διευκολύνουν την προσθήκη μιας επιθυμητής τροποποίησης. Σημαντικοί παράγοντες που πρέπει να ληφθούν υπόψη περιλαμβάνουν τη χημική εξειδίκευση του σταυροειδούς σύνδεσης για μια συγκεκριμένη λειτουργική ομάδα μαζί με συγκεκριμένες πλευρικές αντιδράσεις που θα μπορούσαν να συμβούν, αν ο απαιτούμενος διασυνδέτης πρέπει να είναι ετερο- ή ομο-διλειτουργικός, το μήκος του βραχίονα διαχωριστή που αντιπροσωπεύει την απόσταση μεταξύ των δύο τμημάτων διασταύρωσης και τη διαλυτότητα του παράγοντα διασταύρωσης σε νερό ή σε κατάλληλο οργανικό διαλύτη.1 Οι ομο-διλειτουργικοί διασυνδέτες μπορούν να οδηγήσουν σε αυτοσύζευξη και πολυμερισμό, ενώ οι ετερο-διλειτουργικοί παράγοντες επιτρέπουν ελεγχόμενες διαδοχικές αντιδράσεις που ελαχιστοποιούν την ακούσια ενδομοριακή διασύνδεση.

Ετικέτες

Στην απλούστερη προσέγγιση, ένζυμα όπως η υπεροξειδάση χρένου ή η αλκαλική φωσφατάση μπορούν να προσκολληθούν ομοιοπολικά σε αντισώματα και να χρησιμοποιηθούν σε ανοσοπροσδιορισμούς, στυπώματα Western, προσδιορισμούς ανοσοϊστοχημείας και άλλες εφαρμογές. Η επισήμανση αντισωμάτων με βιοτίνη είναι επίσης μια χρήσιμη και απλή τεχνική. Η συγγένεια της αβιδίνης για τη βιοτίνη επιτρέπει την ανίχνευση των συζευγμένων με βιοτίνη αντισωμάτων. Επιπλέον, τα βιοενεργά αντιδραστήρια με σήμανση φθορισμού είναι κατάλληλα για χρήση σε ανοσοφθορισμό, κυτταρομετρία ροής και άλλες βιολογικές εφαρμογές.1

Κάθαρση

Μετά τη σύζευξη, το αντίσωμα πρέπει να καθαριστεί. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν διαφορετικοί τύποι χρωματογραφίας – αποκλεισμός μεγέθους, ανταλλαγή ιόντων, αντίστροφη φάση ή συγγένεια – ή αιμοκάθαρση. Όλες οι προσεγγίσεις καθαρισμού έχουν πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα ανάλογα με τη μέθοδο.

Αποθήκευση

Ανάλογα με την ποσότητα του επισημασμένου αντισώματος και τις πειραματικές ανάγκες, μπορεί να απαιτείται βραχυπρόθεσμη ή μακροπρόθεσμη αποθήκευση. Τυπικά, η σύσταση είναι να αποθηκεύονται τα συζεύγματα αντισωμάτων στους 4°C. Το αποστειρωμένο φιλτράρισμα μπορεί να βοηθήσει στην επέκταση της μακροπρόθεσμης σταθερότητας, αναστέλλοντας τη μικροβιακή μόλυνση. Εάν ένας αντιμικροβιακός παράγοντας, όπως το αζίδιο του νατρίου, πρόκειται να προστεθεί στο συζυγές αντισώματος, βεβαιωθείτε ότι δεν θα επηρεάσει την απόδοση στις προβλεπόμενες αναλύσεις. Γενικά, η αποθήκευση ενός αντισώματος ή συζυγών αντισώματος σε συγκέντρωση πρωτεΐνης >1 mg/mL θα διατηρήσει υψηλότερη δραστικότητα.1

Νέες μέθοδοι επισήμανσης

Μέθοδοι που βασίζονται στη συγγένεια έχουν αναπτυχθεί για να ξεπεραστούν οι περιορισμοί της μη ειδικής σύζευξης αντισωμάτων χρησιμοποιώντας παραδοσιακές μεθόδους τυχαίας σύζευξης, για να κατευθύνουν τη σύζευξη σε μια συγκεκριμένη θέση στο αντίσωμα, για να αποφευχθούν παρεμβολές στις ιδιότητες δέσμευσης στόχου του αντισώματος και για να αποκτηθεί ο έλεγχος του αριθμού των μορίων αναφοράς που συνδέονται ανά αντίσωμα. Η δυνατότητα χρήσης αυτών των μεθόδων που βασίζονται στη συγγένεια για την επισήμανση αντισωμάτων ακόμη και όταν υπάρχουν σε πολύπλοκα μείγματα τα καθιστά ευρέως εφαρμόσιμα σε πολλά διαφορετικά δείγματα.2

Η μεταφορά του σήματος ανάγνωσης από την πρωτεΐνη στο επίπεδο του DNA με ένα συζευγμένο με ολιγονουκλεοτίδιο αντίσωμα αυξάνει την ευαισθησία των πρωτεϊνικών δοκιμασιών κατά τάξεις μεγέθους και επιτρέπει νέες στρατηγικές πολυπλεξίας. Οι Wiener et al., αντιμετώπισαν τα σημεία συμφόρησης στη δημιουργία μεγαλύτερων πλαισίων αντισωμάτων συζευγμένων με ολιγονουκλεοτίδια συνδυάζοντας μια τεχνική σύζευξης αντισωμάτων που δεν κατευθύνεται στη θέση χρησιμοποιώντας χημεία κλικ χωρίς χαλκό με χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων για να ληφθούν καθαρά μονού και διπλά συζευγμένα με ολιγονουκλεοτίδια αντισώματα. Πέτυχαν αποδόσεις σύζευξης 30% με αρχική ποσότητα τόσο χαμηλή όσο δεκάδες νανογραμμάρια αντισώματος.3

Παρά τις καινοτομίες στις μεθόδους επισήμανσης και τα αναφερόμενα μόρια, είναι σημαντικό να ελέγχετε και να χαρακτηρίζετε πάντα το νέο συζυγές αντισώματος που δημιουργείται πριν από την εφαρμογή. Μπορείτε να ελέγξετε για σωστή επισήμανση, για παράδειγμα, προσδιορίζοντας την αναλογία βαφής προς πρωτεΐνη και συγκρίνοντας τα επισημασμένα αντισώματα με μη επισημασμένα σε εφαρμογές όπως τα western blots ή ο ανοσοφθορισμός για να διασφαλίσετε ότι η ειδικότητά τους και τα μοτίβα χρώσης παραμένουν τα ίδια.

βιβλιογραφικές αναφορές

  1. Berg EA και Fishman JB. Αντισώματα επισήμανσης, Cold Spring Harb Protoc; doi:10.1101/pdb.top099242
  2. von Witting E, Hober S και Kanje S. Μέθοδοι με βάση τη συγγένεια για τη σύζευξη αντισωμάτων ειδικής θέσης. Bioconjugate Chem. 2021, 32, 1515−1524
  3. Wiener, J., Kokotek, D., Rosowski, S. et al.Παρασκευή συζεύξεων αντισωμάτων μονού και διπλού ολιγονουκλεοτιδίου και εφαρμογή τους για αναλύσεις πρωτεϊνών. Sci Rep 10, 1457 (2020). org/10.1038/s41598-020-58238-6